在本综述中，我们聚焦于受激发射损耗（STED）显微技术的最新进展，涵盖光学、计算显微与探针设计等方面，这些进展使得 STED 成像能够在诸如活细胞与组织等具有挑战性的样品中开辟新的观测窗口。我们展示了若干应用实例，其中 STED 数据对于在多种细胞类型与模型系统中获得新的生物学见解至关重要。最后，我们讨论了在我们看来有助于进一步推进 STED 成像所需的重要标准化工作，包括开放且可共享的软件、分析流程、数据存储库以及样品制备方案。

受激发射损耗成像的实用指南

受激发射损耗（STED）显微镜的商业化使该技术更易获取且更易使用。然而，由于其光学结构复杂、成像采集需设置的参数繁多，初次接触这种新方法仍可能令人望而生畏。

标准样品

为确保 STED 显微镜运行正常，应首先使用标准样品。对比日常成像有助于判断出现的问题是由生物学变异和次优的样品制备所致，还是由硬件问题（如光束不对准或照明功率损失）引起。标准样品的例子包括荧光标记微球、DNA 折纸，或已知的细胞结构（如丝状结构）。通常，即便经过多次清洗，过量的与 STED 探针偶联的抗体或纳米抗体仍可能稀疏地附着在盖玻片上，典型地位于细胞间的空间；它们可用于在 STED 图像中直接测试信噪比与空间限域。

检测硬件故障与失准

无论是自制系统还是商用系统，都需要适当维护，因为温度和湿度的变化常会导致失准。空间失准可能发生在涡旋光束（vortex beam）未与激发光束（excitation beam）同心，或这对光束未与探测器同心的情况下。空间重合需要在焦平面内和轴向上同时完成。快速诊断失准的方法是比较 STED 与共聚焦图像。如果在相同的激发强度下拍摄一对图像，而当 STED 光束开启时光子计数显著下降，则硬件未正确工作。此外，如果同一结构在两幅图像中的中心位置发生偏移，则很可能是激发光束与损耗光束之间的失准所致。可进一步使用金纳米颗粒或荧光微球交替照射两种光束并检查点扩散函数（PSF）的位置，以调查故障原因。借此也可检测像差，因为像差会导致光束不对称。空间光束失准的结果是图像质量差、信噪比低，且在严重情况下，当开启 STED 光束时可能完全检测不到信号。然而，相应的共聚焦图像不应受到影响。失准也可能是时间上的，在使用脉冲式 STED 激光时尤为如此：为提高损耗效率，STED 脉冲通常相对于激发脉冲延迟数百皮秒。硬件故障可能改变这一延迟。在这种情况下，空间分辨率不会提高，共聚焦与 STED 图像之间仅能看到极小差异。

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